Разработка микрочиповой аналитической системы с лиофилизированными ПЦР реагентами в алюминиевых микрочипах, модифицированных методом плазменно-химического осаждения

Abstract

Микрочиповые аналитические системы для молекулярно-генетического анализа в последние годы привлекают повышенный интерес исследователей. Алюминиевые микрочипы являются особенно перспективными для внедрения микрочипового формата полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную практику. Подобные микрочипы требуют пассивации поверхности для предотвращения ингибирования ПЦР и улучшения аналитических характеристик системы. Привлекательна и возможность снижения трудозатрат и ошибок оператора за счет лиофилизации реактивов в микрочипах. Микрочипы с лиофилизированными реактивами позволяют избежать сложностей, связанных с хранением при низкой температуре, сокращают количество стадий пипетирования и тем самым уменьшают риск ложноположительных результатов, которые могут быть вызваны контаминацией проб. В работе предложен метод иммобилизации реагентов для ПЦР в микрореакторах алюминиевых микрочипов, поверхность которых была предварительно пассивирована с помощью плазмохимического осаждения из газовой фазы (ПХО). В качестве модельных объектов для лиофилизации выбраны тест-системы для определения фрагмента гена 35S вируса мозаики цветной капусты, используемого в генетически-модифицированных организмах (ГМО), фрагмента геномной ДНК микроорганизма Mycoplasma hominis, а также фрагмента гена глобина человека (белковая часть гемоглобина человека). Разработана экспериментальная установка для лиофилизации, которая позволила оптимизировать условия проведения процесса. Показано, что полученные таким образом алюминиевые микрочипы могут храниться не менее двух месяцев при комнатной температуре, и их аналитические характеристики сравнимы с ПЦР с использованием жидких реактивов, при в 20 раз меньшем потреблении реактивов и в 2-3 раза меньшем количестве операции пипетирования.

Microchip analytical systems for the polymerase chain reaction (PCR) have attracted an increased interest of researchers in recent years. Aluminum microchips are particularly promising for the microchip PCR techniques implementation in a routine laboratory practice. However, the surface of the chips needs to be chemically inert for the PCR inhibition prevention and improved analytical characteristics of the system. It should also be noted that the possibility of decreasing of handling procedures and operator mistakes by using lyophilized reagents inside microreactor remains very attractive. Such microchip systems allow avoiding some of the storage difficulties and significantly decrease the number of pipetting stages. All of these lead to minimizing the risk of false positive results due to the sample cross-contamination. In this paper a method of PCR reagents lyophilization into the microreactors of aluminum microchips was developed. The surface of the microchip was modified using the Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PE CVD). As the model reagents for the lyophilization, the PCR test systems for 35S gene fragment determination (cauliflower mosaic virus) and human globin (protein part of human GEM) were used. The newly developed experimental system for lyophilization allowed optimizing the process for several microchips. It was shown that the obtained aluminum microchip could be stored under the ambient conditions up to 5 months and their analytical characteristics are comparable with the test-tube PCR, with 20 times less the reagents consumption and 2-3 times less the number of pipetting steps.