Определение энантиомерной чистоты пеметрексида на сорбентах с иммобилизованными макроциклическими антибиотиками

Abstract

Исследовано энантиоразделение пеметрекседа на сорбентах с иммобилизованными на поверхности силикагеля макроциклическими гликопептидными антибиотиками. Пеметрексед относится к фармакологической группе антиметаболидов, обладающих противоопухолевой активностью; структурный аналог фолиевой кислоты. Систематическое (ИЮПАК) наименование динатриевая соль (2S)-2-[[4-[2-(2-амино-4-оксо-4,7-дигидро-1H-пиррол[2,3-d]пиримидин-5-ил)этил]бензоил]-глутаминовой кислоты гептагидрат, действующее вещество - L-изомер пеметрекседа. Механизм противоопухолевого действия пеметрекседа обусловлен ингибированием синтеза пуринов и пиримидинов. Для того чтобы выявить, как влияет структура антибиотика, взятого в качестве хирального селектора, на энантиоразделение веществ, для разделения энантиомеров использовали неподвижные фазы с отличающимися по своей структуре антибиотиками - эремомицином (коммерческая колонка Nautilus-E (ЗАО «Био-Хим-Мак», Россия)) и агликоном тейкопланина (ChirobioticTAG (Astec, США)). Разделение энантиомеров проводили в обращенно-фазовом и полярно-ионном режимах хроматографии. Для разделения энантиомеров в обращенно-фазовом режиме хроматографии в качестве подвижной фазы использовали смесь раствора дигидрофосфата аммония (NH₄H₂PO₄) и органических растворителей - метанол (MeOH), ацетонитрил (ACN), в полярно-ионном режиме - органические растворители (метанол, ацетонитрил) с добавками кислот (ледяная уксусная кислота и муравьиная кислота) и оснований (триэтиламин и диэтиламин). Исследовали влияние природы и концентрации компонентов подвижной фазы, ее состава и pH на разделение энантиомеров пеметрекседа на силикагеле, модифицированном эремомицином и агликоном тейкопланина. Энантиомеры пеметрекседа удалось разделить с разрешением 2.8-3.3 на колонке Nautilus-E в обращенно-фазовом режиме. Полярно-ионный режим хроматографии не дал положительных результатов, разделить энатиомеры не удалось: пеметрексед практически не удерживался на колонке (значение фактора удерживания k` = 0.1 ÷ 0.3) независимо от концентрации добавки кислоты и амина в подвижную фазу. Проведенные исследования энантиоразделения пеметрекседа на сорбенте с агликоном тейкопланина в обращенно-фазовом и полярно-ионном режимах хроматографии показали, что энантиомеры пеметрекседа невозможно разделить с данным селектором. Агликон тейкопланина содержит только одну аминогруппу, по сравнению с тремя у эремомицина, что уменьшает электростатические взаимодействия между макроциклическим антибиотиком и пеметрекседом, и на сорбенте, модифицированным агликоном тейкопланина, он удерживается слабо. Эремомицин содержит значительно больше хиральных центров по сравнению с агликоном тейкопланина Кроме того, лучшая селективность разделения энантиомеров реализуется за счет образования водородных связей и дипольных взаимодействий с амидными и гидроксильными группами эремомицина и за счет гидрофобных взаимодействий. Показана возможность определения энантиомерной чистоты фармацевтического препарата на колонке Nautilus-E при элюировании подвижной фазой: (55 : 15 : 30) % об. MeOH : ACN : NH₄H₂PO₄ (50 мM, pH = 2.5), время анализа составляет меньше 10 минут, D-изомер не обнаружен. Предел обнаружения соединения, оцененный по отношению сигнал/фон = 3 : 1 составил 0.0003 мг/мл, что соответствует 0.12 % мас. D-формы по отношению к общему количеству препарата.

The enantioseparation of Pemetrexed on chiral sorbents with macrocyclic glycopeptide antibiotics as chiral selectors was investigated. The pharmacological group of Pemetrexed is antimetabolites with antitumor activity. Pemetrexed is a structural analog of folic acid. IUPAC name of this drug is disodium (2 S )-2-[[4-[2-(2-amino-4-oxo-4,7-dihydro-1 H -pyrrolo[2,3- d ]pyrimidin-5-yl)ethyl]benzoyl]amino]pentanedioate heptahydrate. The mechanism of Pemetrexed antitumor action is based on the inhibition of the synthesis of purine and pyrimidine. Chiral stationary phases with antibiotics of different structures were used. Columns with silica modified antibiotic eremomycin (commercial column Nautilus-E, Bio-Chem-Mac, Russia) and silica with teicoplanin aglycone (ChirobioticTAG, Astec, USA) were applied. The separation of the enantiomers was carried out by the reversed-phase and polar-ion chromatography modes. The mobile phase in the reversed-phase chromatography mode was a mixture of ammonium dihydrogenphosphate solution and organic solvents (methanol, acetonitrile), and in polar-ion mode - organic solvents (methanol, acetonitrile) with additives of acids (acetic acid, formic acid) and bases (triethylamine, diethylamine). The influence of the components’ nature and concentration in the mobile phase, their composition and pH on the separation of Pemetrexed enantiomers was investigated using the silica modified eremomycin and teicoplanin aglycone. The resolution of Pemetrexed enantiomers was 2.8 - 3.3 in the reverse phase mode on the column with eremomycin. In the polar-ion mode chromatography, Pemetrexed eluted with dead volume (capacity factor k ` = 0.1 ÷ 0.3) independently of the additives concentrations in the mobile phase. The enantiomers of Pemetrexed were not separated on the column with teicoplanin aglycone. Teicoplanin aglycone has one amino-group only, whereas eremomycin has three amino-groups. Electrostatic interactions between teicoplanin aglycone and Pemetrexed were less than interactions between eremomycin and Pemetrexed. Eremomycin has more chiral centers than teicoplanin aglycone. In addition, hydrophobic interactions, hydrogen bonds and dipolar interactions with amide and hydroxyl groups of eremomycin provide high enantioselectivity of sorbent with eremomycin. The determination of enantiomeric purity of Pemetrexed drug on the column with eremomycin was conducted. Mobile phase was (55:15:30) MeOH:ACN:NH₄H₂PO₄ (50mM, pH = 2.5). The time of analysis was less than 10 minutes. D-isomer was not detected in the drug. The limit of detection of Pemetrexed D-enantiomer was 0.0003 mg/ml (assumed 3:1 signal to noise ratio) which constituted 0.12 % from the total amount drug.