Хроматографическое и хромато-масс-спектрометрическое определение противотуберкулезных препаратов основного ряда в плазме крови

Abstract

В работе выявлены возможности одновременного определения четырех противотуберкулезных препаратов (ПТП) ( этамбутол, пиразинамид, изониазид, рифампицин ) методами обращённо-фазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) и ион-парной хроматографии. Предложен вариант одновременного определения этих ПТП в плазме крови человека методом ОФ ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием с электроспрей ионизацией. Детектирование осуществляли в режиме положительной ионизации путём мониторинга множественных реакций (MRM). Оптимизированы условия фрагментации для каждого лекарственного вещества. Найдены условия подготовки плазмы крови к ВЭЖХ/МС анализу, включающие осаждение белков плазмы крови ацетонитрилом. Значения степеней извлечения ПТП составили 85-90 %. Проведена оценка влияния матрицы пробы на разделение и ионизацию ПТП методом пост-экстракционной добавки. Показано, что разбавление экстракта плазмы крови в 10 раз достаточно для требуемого снижения матричного эффекта. Изучена стабильность ПТП в процессе анализа (автосамплер 1 и 12 ч.) и в условиях хранения (3 цикла заморозка-разморозка). Предложен способ увеличения стабильности рифампицина с добавлением в качестве антиоксиданта аскорбиновой кислоты (1 мг/мл). Пределы обнаружения с УФ детектированием составили от 2 до 20 мкг/мл, с МС детектированием в SIM-режиме от 2 до 15 нг/мл и в MRM-режиме от 0.5 до 10 нг/мл. В оптимизированных условиях показана возможность обнаружения и количественного определения всех четырех ПТП в плазме крови больного туберкулезом с проводимой лекарственной терапией.

In the current study the possibility of the simultaneous determination of anti-tuberculosis (anti-TB) drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol and rifampicin) using the reversed-phase HPLC (RP-HPLC) and ion-pair chromatography was investigated. A selective and highly sensitive liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of four anti-TB drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol and rifampicin) in the human plasma was developed. The detection was carried out using the multiple reaction-monitoring (MRM) modes with positive polarity. The fragmentation conditions for each drug were optimized, and the conditions for the blood plasma preparation for HPLC/MS analysis, including the protein precipitation with ACN with a ratio of 3:1 (by volume), were chosen. The matrix effects on the separation and ionization of anti-TB drugs were estimated by the post-extraction additives method. It was shown that the 10-fold dilution of plasma extracts was sufficient to decrease the influence of the sample matrix. The stability of anti-TB drugs during the analysis (in autosampler at 1 and 12 hours) and at storage conditions (3 cycles of freeze-thaw) was studied. The method for increasing the stability of rifampicin using ascorbic acid (1 mg/ml) as antioxidant was provided. The LOD with UV detection were 2 - 20 µg/ml, in SIM-mode - 2 - 15 ng/ml and in MRM-mode - 0.5 - 10 ng/ml respectively. The possibility of the determination of four anti-TB drugs in real plasma samples of patients with tuberculosis undergoing drug therapy in optimized conditions HPLC/MC was shown.