Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием

Abstract

Впервые предложена двухстадийная методика определения этерифицированных жирных кислот (ЭЖК) и свободных жирных кислот (СЖК) с использованием экстрактивного алкилирования. В крови человека ЭЖК в связанном виде входят в состав эфиров моно-, ди-, триглицеридов, а также глицерофосфолипидов. Перечень определяемых ЖК включает 12 насыщенных кислот (С₁₁-С₂₄ и 20 ненасыщенных кислот (С₁₆-С₂₄), в том числе ω-3, ω-6, ω-9 и полиненасыщенные жирные кислоты. Предложенная методика включает две стадии: переэтерификацию ЭЖК с помощью КОН в МеОН в метиловые эфиры с последующим их извлечением из матрицы и экстрактивное метилирование СЖК иодистым метилом в CH₂Cl₂ в присутствии гидроксида тетрабутиламмония. Количественное определение выполняли методом относительной градуировки с использованием пальмитиновой кислоты-d₃₁ и метилпальмитата-d₃₁ в качестве внутренних стандартов. Разработанный метод позволяет проводить количественное определение жирных кислот в плазме крови во всем диапазоне реальных концентраций. Диапазон измеряемых концентраций в плазме крови составляет от 0.2 до 800 мкг/мл. Относительная погрешность определения большинства аналитов не превышает 15 %. Методика характеризуется мягкими условиями проведения подготовки проб: комнатная температура и pH = 8 на стадии экстрактивного алкилирования. Благодаря мягким условиям отсутствуют или проходят в незначительной степени побочные реакции окисления и гидролиза. Показано, что во время процедуры извлечения этерифицированных жирных кислот не происходит конверсии ЭЖК в СЖК. Методика опробована при исследовании образцов плазмы крови людей.

A GC-MS method was developed for quantification of 32 free and esterified fatty acids: 12 saturated fatty acids (C₁₁-C₂₄) and 20 unsaturated and polyunsaturated fatty acids (C₁₆-C₂₄). GC-MS quantification was performed in two stages. At first, esterified fatty acids were converted to methyl esters by transesterification with KOH in MeOH. At the second stage free fatty acids were converted to methyl esters by extractive alkylation with methyl iodide in CH₂Cl₂ and tetrabutylammonium hydroxide. Relative calibration was performed with deuterated palmitic acid and methyl palmitate as internal standards. Range of measured concentrations was 0.2 to 800 mkg/ml. Relative standard deviation was below 15%. The soft conditions for preparing the samples tested lead to the absence of or minor transesterification side reactions, oxidation and hydrolysis. It is proved that during the extraction procedure esterified fatty acid does not increase the concentration of free fatty acids, indicating the absence of conversion of esterified to free fatty acids. The technique was tested in the study of fatty acids of blood plasma of human volunteers.