Высокочувствительная иммунохроматография на основе концентрирования аналитов конъюгатами антител и стабилизированных магнитных частиц

Abstract

Магнитные частицы (МЧ) с иммобилизованными на их поверхности антителами – эффективный компонент аналитических систем, обеспечивающий селективное связывание контролируемых соединений из больших объемов проб, простое и быстрое концентрирование при наложении внешнего магнитного поля и последующее высокочувствительное выявление. Однако для аналитического применения МЧ необходимо покрытие их поверхности, исключающее агрегацию частиц и неспецифические взаимодействия с ними компонентов проб. В статье представлены результаты исследования, включавшего синтез, модификацию МЧ и их применение в иммунохроматографических тест-системах. МЧ получали, восстанавливая смесь хлоридов железа (II) и (III) аммиаком в различных условиях. В качестве стабилизаторов поверхности использовали олеиновую кислоту, тетраэтоксисилан и его смесь с (3-аминопропил)триэтоксисиланом. Варьируя рН и температуру реакционной среды, соотношения МЧ и стабилизаторов, продолжительность ультразвуковой обработки и последующей инкубации реагентов, получили 20 препаратов поверхностно модифицированных МЧ. Размеры и коллоидную стабильность препаратов характеризовали методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света. Выбранные МЧ адсорбционно конъюгировали с антителами к различным низкомолекулярным веществам (антибиотики, гормонально активные соединения) и применяли полученные конъюгаты для концентрирования аналитов из разных объемов проб. Разработаны иммунохроматографические тест-системы, в которых используются ресуспендируемые комплексы (МЧ – антитела – аналит). Предложенное иммуномагнитное концентрирование снизило минимальные выявляемые концентрации аналитов по сравнению с традиционной иммунохроматографией до 20 раз (контроль тетрациклина, предел обнаружения 1.5 нг/мл). Методика объединяет три быстрые стадии – связывание аналита (2 мин), магнитное разделение (2 мин) и иммунохроматографию (от 7 мин), позволяя проводить тестирование без использования стационарного оборудования и с возможностью визуальной оценки результатов.

Magnetic particles (MPs) with antibodies immobilized on their surface are an effective component of analytical systems, providing selective binding of controlled compounds from large volumes of samples, simple and rapid concentration using applied external magnetic field, and subsequent highly sensitive detection. However, analytical use of MPs requires coating their surface for eliminating particle aggregation and non-specific interactions with sample components. The article presents the results of a study that included synthesis, modification of MPs and their application in immunochromatographic test systems. MPs were prepared by reducing a mixture of iron (II) and (III) chlorides with ammonia under various conditions. Oleic acid, tetraethoxysilane and its mixture with (3-aminopropyl)triethoxysilane were used as surface stabilizers. Temperature and pH of the reaction medium, the ratio of MPs and stabilizers, the duration of ultrasonic treatment and subsequent incubation of the reagents were varied and 20 samples of surface-modified MPs were prepared. Size and colloidal stability of the samples were characterized by transmission electron microscopy and dynamic light scattering. Selected MPs were adsorptionally conjugated with antibodies to various low-molecular substances (antibiotics, hormonally active compounds) and the resulting conjugates were used to concentrate analytes from different sample volumes. Immunochromatographic test systems that use resuspended complexes (MP – antibodies – analyte) were developed. The proposed immunomagnetic concentration reduced the minimum detectable concentrations of analytes by up to 20 times compare to traditional immunochromatography (tetracycline control, detection limit 1.5 ng/ml). The method combines three rapid stages – analyte binding (2 min), magnetic separation (2 min) and immunochromatography (from 7 min), allowing testing without the use of stationary equipment and with the possibility of visual assessment of the results.